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無需病毒載體，實現(xiàn)對人類T細(xì)胞高效、精準(zhǔn)的基因改造，這是科學(xué)家們最新發(fā)表在Nature雜志上的突破成果。而“魔剪”CRISPR又在其中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。研究人員認(rèn)為，這一成果對科研、醫(yī)學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域具有重大意義，將大大加快下一代細(xì)胞療法的發(fā)展，為癌癥等疾病的治療帶來新希望。

病毒引發(fā)感染是通過注射它們自己的遺傳物質(zhì)。自上世紀(jì)70年代以來，科學(xué)家們就已經(jīng)開始運用病毒的這一特性：利用病毒載體運送DNA到細(xì)胞中，用于研究、基因療法等。

然而，構(gòu)建病毒載體其實是一個非常艱苦、昂貴的過程，臨床級載體（clinical-grade vectors）的短缺還導(dǎo)致了基因療法和細(xì)胞療法的生產(chǎn)瓶頸。此外，即使是可用的，病毒載體也遠(yuǎn)不是一種理想的工具，因為它們會將基因隨意插入到細(xì)胞基因組中，這將損害現(xiàn)有的健康基因或使新引入的基因不受確保細(xì)胞正常運作的調(diào)節(jié)機制的控制。這些局限性可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，已經(jīng)引起了人們對基因療法和細(xì)胞療法（如CAR-T）的擔(dān)憂。

擺脫“病毒”的新技術(shù)

7月11日，發(fā)表在Nature雜志上題為“Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting”的研究中，來自加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的科學(xué)家們開發(fā)出了一種在不使用病毒插入DNA的前提下就能“重寫”人類T細(xì)胞基因組的強大技術(shù)。

具體來說，該技術(shù)依賴于電穿孔：將一個電場應(yīng)用于細(xì)胞，使得細(xì)胞膜暫時具有更大的滲透性。經(jīng)過一年的探索，UCSF的Alex Marson博士帶領(lǐng)的團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一定數(shù)量的T細(xì)胞、DNA和CRISPR被混合在一起，然后暴露于適當(dāng)?shù)碾妶龊�，T細(xì)胞能夠精準(zhǔn)整合特定的基因序列到基因組中被CRISPR切割的位點。

為了展示新技術(shù)的多功能性和實力，Marson博士等利用它修復(fù)了T細(xì)胞中的一種致病基因突變，并且創(chuàng)造出了能夠找到和殺死人類黑色素瘤細(xì)胞的“定制T細(xì)胞”。

據(jù)論文第一作者Theodore L. Roth介紹，科學(xué)家們嘗試將新基因插入T細(xì)胞已有30年之久。在他們的研究中，經(jīng)過近一年的反復(fù)試驗，Roth確定了T細(xì)胞數(shù)量、DNA數(shù)量和CRISPR豐度（CRISPR abundance）的比值，結(jié)合擁有適當(dāng)參數(shù)的電場，實現(xiàn)了對T細(xì)胞基因組高效、準(zhǔn)確的編輯。

“實力”驗證

研究中，Roth首先設(shè)計CRISPR用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標(biāo)記一組不同的T細(xì)胞蛋白，結(jié)果證實，新技術(shù)具有高度的特異性，且脫靶效應(yīng)水平非常低：GFP只在特定的細(xì)胞位置和結(jié)構(gòu)中表達(dá)。

接著，他們開始驗證新技術(shù)的治療前景。在第一個實驗中，Roth及其同事使用了由耶魯醫(yī)學(xué)院Kevan Herold提供給Marson博士實驗室的T細(xì)胞。這些細(xì)胞來自患罕見、嚴(yán)重自身免疫性疾病的三個兄弟姐妹。基因組測序顯示，這些兒童的T細(xì)胞攜帶著IL2RA基因的突變。而IL2RA基因編碼的是對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs，可抑制其他免疫細(xì)胞，阻止自身免疫）發(fā)育至關(guān)重要的一種細(xì)胞表面受體。

利用基于CRISPR的新技術(shù)，UCSF的團(tuán)隊快速修復(fù)了兒童T細(xì)胞中的IL2RA缺陷，以及因突變受損的細(xì)胞信號。研究人員希望，就像利用CAR-T療法抗癌一樣，類似的技術(shù)能夠有效治療自身免疫性疾病。

在第二個實驗中，借助新技術(shù)，科學(xué)家們用“被專門設(shè)計用于識別人類黑色素瘤細(xì)胞特殊亞型的新受體”完全取代了“正常人類T細(xì)胞中的天然T細(xì)胞受體（T cell receptors，細(xì)胞用于檢測疾病和感染的傳感器）”。在培養(yǎng)皿中，被改造過的T細(xì)胞表現(xiàn)出了特異性：不僅能夠有效地找到目標(biāo)黑色素瘤細(xì)胞，同時還會忽略其他細(xì)胞。這對于癌癥精準(zhǔn)治療是非常重要的。

研究人員強調(diào)，在不使用病毒載體的情況下，他們能夠生產(chǎn)出大量經(jīng)CRISPR改造后表達(dá)新T細(xì)胞受體的工程細(xì)胞。而將這些CRISPR工程細(xì)胞（CRISPR-engineered cells）移植給攜帶人類黑色素瘤的小鼠后，它們能夠進(jìn)入腫瘤部位，并顯示出抗癌活性。